引言

樣品制備在使用色譜法進(jìn)行生物分析中至關(guān)重要。如果不進(jìn)行任何樣品制備步驟，例如蛋白沉淀、磷脂去除 (PLR)、液液萃取 (LLE) 或固相萃取 (SPE)，系統(tǒng)性能將受到負(fù)面影響。常見(jiàn)的問(wèn)題包括高效液相色譜 (HPLC) 管路堵塞、色譜柱污染、質(zhì)譜儀源污染以及靈敏度下降。

樣品制備方法的清潔性能各不相同，其中蛋白沉淀是用于色譜分析生物樣品（如血漿或血清）流行的方法之一。這是一種快速且簡(jiǎn)單的操作 - 將樣品加入溶劑后引發(fā)蛋白沉淀，最終通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾液體，獲得無(wú)蛋白的樣品。

盡管蛋白沉淀可以去除蛋白，但它無(wú)法去除其他基質(zhì)成分，例如磷脂。這些基質(zhì)成分在進(jìn)行 LC-MS/MS 分析時(shí)會(huì)引發(fā)以下問(wèn)題：

1. 磷脂會(huì)影響質(zhì)譜儀源中的離子化，通常表現(xiàn)為離子抑制，更少見(jiàn)的是離子增強(qiáng)，從而降低分析的穩(wěn)健性。^[1]

2. 磷脂會(huì)污染質(zhì)譜儀源，導(dǎo)致維護(hù)成本增加，同時(shí)儀器停機(jī)時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。

3. 磷脂會(huì)在 HPLC 柱上積累，隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致柱背壓升高并縮短柱的使用壽命。^[2]

樣品制備的改進(jìn)技術(shù)

磷脂去除（PLR）是一種用于生物樣本分析的樣本制備技術(shù)。PLR與蛋白沉淀板的操作流程相似，但其產(chǎn)品中加入了一種活性成分，可以捕獲磷脂而不保留目標(biāo)分析物（如圖1所示）。因此，PLR為生物樣本制備提供了全面的解決方案。

圖1 - 用于制備用于LC-MS分析的血漿的簡(jiǎn)單PLR。

在本應(yīng)用說(shuō)明中，比較了兩種常用樣品制備方法（磷脂去除PLR和蛋白沉淀）在LC-MS/MS 分析中對(duì)牛血漿樣品的磷脂去除效果和分析物回收率的差異。

用于制備磷脂去除樣品的是 Microlute® PLR 板。

Microlute® 系列采用新穎的復(fù)合技術(shù)（圖 2），該技術(shù)將捕獲磷脂的活性材料與惰性聚乙烯結(jié)構(gòu)相結(jié)合。這種設(shè)計(jì)通過(guò)提高樣品流入收集板的流動(dòng)一致性，改善了樣品制備的重復(fù)性，從而具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖 2 – Microlute® 復(fù)合技術(shù)的示意圖

實(shí) 驗(yàn)

血漿樣品的制備

將普魯卡因胺以三種不同濃度（25 ng/mL、250 ng/mL 和 1250 ng/mL）加入牛血漿中。溶液混勻后靜置平衡一小時(shí)。

校準(zhǔn)曲線的制備

取 100 µL 未加標(biāo)的空白血漿，加入到 Microlute® PLR板的四個(gè)孔中，隨后加入 300 µL 含 1%甲酸（v/v）的乙腈。每個(gè)孔用移液器吸取混勻五次，以確保溶液充分混合并使蛋白質(zhì)沉淀。通過(guò)正壓以每秒一滴的流速將沉淀后的溶液洗脫至1.1 mL 收集板（Porvair Sciences 產(chǎn)品代碼：219250）中。將處理后的血漿混合液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 微量離心管中，并渦旋混勻 10 秒鐘。取 100 µL 混合血漿加入六個(gè)孔中，制備一個(gè)空白標(biāo)準(zhǔn)和五個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。五個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)添加以下濃度的普魯卡因胺溶液制備：10、100、200、500和 1,500 ng/mL。

含標(biāo)血漿的處理

將 100 µL 不同濃度的加標(biāo)血漿分別加入到 Microlute® PLR 板和蛋白沉淀板（Porvair Sciences 產(chǎn)品代碼：240100）的孔中，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每種濃度做兩次重復(fù)。每孔加入 300 µL 含 1% 甲酸（v/v）的乙腈。用移液器吸取液體五次，以確保溶液充分混合并使蛋白質(zhì)沉淀。隨后通過(guò)正壓以每秒一滴的流速將沉淀后的溶液洗脫至 1.1 mL 收集板中。

稀釋步驟

為改善 LC-MS/MS 方法的峰形及穩(wěn)定性，將處理后的加標(biāo)血漿和標(biāo)準(zhǔn)品溶液按 1:10 比例用含 0.1% 甲酸（v/v）的水中稀釋。這一稀釋步驟可防止由于洗脫液有機(jī)強(qiáng)度過(guò)高而導(dǎo)致的不良峰形問(wèn)題。

圖 3 – 普魯卡因胺峰形的疊加比較 – 未稀釋?zhuān)ňG色曲線）與 1:10 稀釋?zhuān)ǔ壬€）

LC-MS/MS 方法用于柱后注入

以下方法用于篩查蛋白沉淀樣品和 Microlute® PLR 樣品中常見(jiàn)的磷脂[3]，并通過(guò)柱后注入法監(jiān)測(cè)任何基質(zhì)效應(yīng)（離子增強(qiáng)/抑制）。注入的溶液是濃度為 100 ng/mL 的普魯卡因胺溶液，以 10 µL/min 的速率注入流動(dòng)相 A 中。

HPLC 條件：

質(zhì)譜儀條件

MRM 過(guò)渡

               LPC =溶血磷脂酰膽堿,   PC = 磷脂酰膽堿,  SM = 神經(jīng)酰胺

用于普魯卡因胺的LC-MS/MS方法

為分析加標(biāo)樣品和校準(zhǔn)曲線，采用了以下LC-MS/MS方法：

質(zhì)譜儀條件

結(jié)果與討論

磷脂去除效果

為分析通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀和復(fù)合PLR技術(shù)（Microlute® PLR）制備的血漿樣本中是否仍然存在磷脂？采用MRM LC-MS/MS方法掃描血漿中的常見(jiàn)磷脂，比較蛋白沉淀法和復(fù)合PLR技術(shù)（Microlute® PLR）的樣品處理效果。

磷脂去除PLR板處理的樣品在色譜圖中幾乎沒(méi)有磷脂信號(hào)，僅有基線噪音，表明樣本中所有干擾分析的磷脂已全被去除（圖4）。而蛋白沉淀樣本則顯示較大峰面積，表明磷脂仍然殘存于樣本中。

       圖 4 – 每個(gè)樣本中磷脂質(zhì)MRM的重疊軌跡        A=蛋白質(zhì)沉淀樣本   B = 磷脂去除板

圖 5 – 使用Microlute® PLR板和蛋白沉淀板處理樣品中的總磷脂峰面積的對(duì)比。Microlute® PLR板處理樣品的總峰面積=5.47 x 104，而蛋白沉淀板處理樣品的總峰面積=1.42 x 108

通過(guò)對(duì)磷脂色譜圖（圖4）的總峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果以柱狀圖形式呈現(xiàn)（圖5）。Microlute® PLR板處理的樣品中磷脂響應(yīng)很低 (5.47 x 104) ，而蛋白沉淀板處理的樣品則顯示非常大的總峰面積 (1.42 x 108).

基質(zhì)效應(yīng) - 離子抑制

為了量化磷脂對(duì)電離的影響，進(jìn)行了普魯卡因胺的柱后注入實(shí)驗(yàn)，同時(shí)注入分別采用蛋白沉淀板和Microlute® PLR板制備的空白樣品。

磷脂去除板（藍(lán)色曲線）顯示，與注入空白溶液（綠色曲線）相比，整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中離子化未受到影響。然而，蛋白沉淀樣品（黑色曲線）由于磷脂的離子抑制作用，在1.5分鐘至2.5分鐘之間的基線出現(xiàn)下降。如圖6所示，在磷脂共同洗脫的區(qū)域（紅色曲線），信號(hào)顯著降低。觀察到的大的信號(hào)下降約為75%，出現(xiàn)在普魯卡因胺的保留時(shí)間約為2分鐘。

圖6 - 普魯卡因胺注入溶劑空白樣品（綠色）、Microlute® PLR處理的樣品（藍(lán)色）以及蛋白質(zhì)沉淀樣品（黑色）的注入痕跡疊加圖。同時(shí)疊加顯示了蛋白沉淀樣品的磷脂痕跡（紅色）。

普魯卡因胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品，以演示使用Microlute® PLR創(chuàng)建的校準(zhǔn)曲線（圖7）。標(biāo)定曲線呈線性，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9995。本研究表明，普魯卡因胺的校準(zhǔn)范圍為10 ng/mL至1500 ng/mL，并且呈線性關(guān)系。

圖7 – 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，范圍從10 – 1500 ng/mL，r2值 = 0.9995。

普魯卡因胺的制備比較——蛋白沉淀法與PLR法

為模擬生物分析方法中使用的質(zhì)量控制（QC）樣品，制備了三種不同濃度的血漿樣品- 低QC（25 µg/mL）、中QC（250 µg/mL）和高QC（1,250 µg/mL），每種濃度均進(jìn)行了兩次重復(fù)，分別采用蛋白沉淀法和Microlute® PLR板進(jìn)行制備。

使用LC-MS/MS對(duì)這些樣品進(jìn)行分析，并通過(guò)比較峰面積來(lái)量化差異的百分比。在很低且很具挑戰(zhàn)性的濃度下，兩種制備方法的峰面積差異為9.6%（見(jiàn)表1）。這表明，兩種制備方法在從血漿中回收普魯卡因胺方面同樣有效。

           表1 – 使用三種不同濃度水平的血漿制備普魯卡因胺的峰面積（每種濃度進(jìn)行兩次重復(fù)）。兩種技術(shù)在各濃度下的峰面積百分比差異。

結(jié) 論

本研究簡(jiǎn)要展示了在生物樣品的色譜分析前進(jìn)行樣品制備的必要性。樣品制備可以避免離子抑制，從而提高信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度，同時(shí)減少儀器維護(hù)需求。此外，通過(guò)比較兩種技術(shù)（蛋白沉淀法和PLR法），結(jié)果表明磷脂去除活性成分并未影響分析物的回收率。這說(shuō)明Microlute® PLR板具有更優(yōu)異的性能，不僅保持了高回收率，同時(shí)減少離子抑制，從而提供更可靠和穩(wěn)健的分析結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

1: O. A. Ismaiel, M. S. Halquist, M. Y. Elmamly, A. Shalaby and H. T. Karnes, “Monitoring phospholipidsfor assessment ofion enhancement and ionsuppression in ESI andAPCI LC/MS/MSfor

chlorpheniramine in human plasma andthe importance of multiplesource matrix effect evaluations,"Journal ofChromatography B,vol. 875, no. 2, pp. 333-343, 2008.

2:J. CarmicalandS. Brown, “The impact of phospholipidsand phospholipid removal on bioanalyticalmethod performance," Biomedical Chromatography,vol. 30, no. 5, pp. 710-720, 2016.

3: G. B. PhillipsandJ.T. Dodge, “Composition of phospholipids and of phospholipidfattyacids ofhuman plasma,"Journal of Lipid Research,vol. 8, no. 6, pp. 676-681, 1967.